近日，我院黄又举教授团队在同时识别多种病原体的双酶诱导比色传感器方面取得新进展。相关研究结果以“Dual enzyme induced colorimetric sensor for simultaneous identifying multiple pathogens”为题发表在Biosensors and Bioelectronics (Q1, IF=12.545)。DOI: 10.1016/j.bios.2023.115344。

世界卫生组织的一份报告指出，每年约2.2亿儿童患有腹泻病，其中约9.6万人因此而死亡。不卫生的饮食导致了腹泻和营养不良的恶性循环，威胁着弱势人群的营养状况。在过去的几十年里，食物中毒在全世界越来越普遍。引起食物中毒的常见食源性细菌包括副溶血性弧菌(VP)、金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(E. coli)、沙门氏菌(SE)和单核细胞增生李斯特菌(LM)等。人在食用严重污染的食物后会导致呕吐、发烧、腹泻，甚至休克。考虑到一种食物中可能有多种细菌存在，开发一种同时检测多种细菌的方法具有重要意义。

目前细菌的识别策略主要包括：细菌与探针之间的静电相互作用、细菌表面分子与其受体之间的相互识别作用、细菌代谢产物与探针之间的化学或生物相互作用。尽管这些方法快速而敏感，但还是存在一些不足，如静电相互作用是一种弱的相互作用，很容易受到周围环境的影响，导致识别能力有限；利用细菌表面分子与其受体间的相互作用的探针通常需要繁复的设计；细菌代谢产物中依据pH的识别也会受到环境的影响，及依据细菌生长过程中释放的挥发物识别则需要较长的时间(10 h)连续监测。同时依据细菌体内控制其生命活动的专一性酶(如碱性磷酸酶)构建的荧光、电化学、SERS、可视化传感器广泛用于单一细菌的检测与识别。通常，基于以上机理所构建的传感器阵列，涉及多个信号探针用于生成读数模式，这在一定程度上增加了检测的复杂性和成本。因此，简化传感器阵列信号探针，开发一种简单、快速、同时可视化识别多种细菌的方法对于其实际应用具有一定的意义。

鉴于此，黄又举教授团队提出并设计了一种基于单探针和双信号识别的酶级联诱导比色法，适用于区分各种不同碱性磷酸酶(ALP)水平的细菌。图1说明了视觉传感系统的三个要素：(1)在具有类氧化酶活性的二氧化锰纳米花(MnO₂ NFs)的催化下，3,3', 5,5'-四甲基联苯胺(TMB)被氧化，进而导致Au NRs逐渐被腐蚀，并产生相应的颜色变化。(2)ALP催化底物产生的抗坏血酸可作为催化剂，将MnO₂ NFs还原为无类氧化酶活性的Mn²⁺，防止Au NRs被蚀刻，并有相反的颜色变化。(3)根据这种比色方法，不同的细菌含有不同水平的ALP，表现为不同的颜色变化。通过将颜色RGB信号转换为数字信号结合紫外-可见吸收波长的信号差异，进行线性判别分析(LDA)，使得多种细菌的识别具有高准确性。并且还可以对五种细菌的混合样品进行准确识别，如图2所示。该方法在快速和简单检测食源性疾病方面具有一定的潜力。

图1 (a-b) 基于双酶级联反应抑制Au NRs蚀刻识别食品中不同细菌的示意图。

图2 不同混合细菌的鉴定。(a, d, g)不同比例的VP/SE混合响应的比色照片、RGB图像、热图和LDA图。(b, e, h) 不同比例的VP/LM混合响应的比色照片、RGB图像、热图和LDA图。(c, f, i)多种不同细菌混合响应的比色彩色照片、RGB图像、热图和LDA图。

杭州师范大学硕士研究生陈卫伟和宁波大学与杭州师范大学联合培养硕士研究生李明为该论文的共同第一作者，杭州师范大学材料与化学化工学院青年教师丁彩萍博士和黄又举教授为该论文的共同通讯作者，杭州师范大学为第一完成单位。该研究工作得到了国家自然科学基金、浙江省自然科学基金和安徽省重点研发计划等项目的资助。